pcr技能操作考试流程
1、 试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的第一个流程,需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行,用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在  -20℃ 保存,除了 ddH2O 之外,其余的试剂组份需完全融化之后再加入,以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行,以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
2. 样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节,在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作,操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行,操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒,注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换,要有「无核酸观念」 。
3. 核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管,装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照(阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照)。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标,其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
4. 产物分析
常见问题:
1)无 CT 值出现:模板量不足(杂质的引入及反复冻融的情况等)
2)CT 值出现过晚(大于 38):各种反应成分的降解或加样量的不足
3)标准曲线线性相关性不佳:加样误差、标准品出现降解等
4)阴性对照有信号:模板有基因组的污染
5)扩增效率低:反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6)扩增曲线的异常:模板的浓度太高或荧光染料的降解
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