荧光偏振原理
心理1.7W
荧光偏振工作原理:
将磷酸化底物进行荧光标记,蛋白激酶产生的磷酸化产物不进行荧光标记。让两种磷酸化产物与抗丝氨酸抗体(丝氨酸和苏氨酸是最常见的磷酸化位点,因为其结构末端含有羟基,羟基很活泼,可以与磷酸基团结合)相竞争结合。
当反应液中没有蛋白激酶产生的磷酸化产物时,荧光标记的磷酸化物与抗体相结合形成复合体,由于复合体较大,运动速率相对较小,受偏振光激发后产生的激发光具有较大的偏振值当反应液中含有蛋白激酶产生的磷酸化产物时,因二者竞争抗体的结合位点,结合到抗体上的荧光标记物较少,游离的荧光标记物在反应液中很多,发出的激发光偏振值减小。
当蛋白激酶的活性越强,产生的磷酸化产物也就越多,与荧光标记物的竞争越激烈,对标记物产生的激发光的性质影响越大,因此偏振的改变直接与蛋白激酶的活性相关。利用这一原理可以检测蛋白激酶活性。
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