分光光度分析法的基本原則

分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長範圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。它具有靈敏度高、操作簡便、快速等優點，是生物化學實驗中最常用的實驗方法。許多物質的測定都採用分光光度法。在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。

基本原理：

選擇吸收

物質與光作用，具有選擇吸收的特性。有色物質的顏色是該物質與光作用產生的。即有色溶液所呈現的顏色是由於溶液中的物質對光的選擇性吸收所致。由於不同的物質其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有特徵結構的結構集團，存在選擇吸收特性的最大實收波長，形成最大吸收峰，而產生特有的吸收光譜。即使是相同的物質由於其含量不同，對光的吸收程度也不同。利用物質所特有的吸收光譜來鑑別物質的存在（定性分析），或利用物質對一定波長光的吸收程度來測定物質含量（定量分析）的方法，稱為分光光度法。

定量依據：

朗伯一比爾（Lambert - Beer）定律是分光光度法定量分析依據的基本原理。當一束單色光（指路由一種顏色的光）通過一均勻的溶液時，一部分被吸收，一部分透過。設入射光的強度為I0，透射光強度為I，則I/I0為透光度，用T表示。百分透過率為 T% = （I/I0）x100%

研究表明：溶液對光的吸收程度即吸光度（A）（又稱消光度E、或光密度D）與透光度（T）呈負對數關係，即：A = - lgT

朗伯定律：有色溶液的吸光程度（A）與其液層厚度（光程）b成正比。當溶液濃度不變時，溶液的液層厚度越大，對光的吸收程度A值越大，則透光度越小。

即：A = ab

比耳定律：有色溶液的吸光程度（A）與其濃度（吸光質點數）C成正比。即當溶液的液層厚度不變時，溶液的濃度越大，對光的吸收程度越大，則透光度越小。

即：A = ac

將以上兩式合併可用下式表示：A = -lgT=abc

即 A = abc。

上式為朗伯比爾定律，其意義為：當一束單色光通過一均勻溶液時，溶液對單色光的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。[3][2]

A =abc 中，吸光係數a，表徵吸光物質的 靈敏度。a值越大，靈敏度越高。如果濃度的單位為物質的量濃度（單位為：mol/L），則吸光係數a可以寫成ε ，ε稱為摩爾吸光係數。

由上式可知，當溶液層厚度b和吸光係數a固定時，吸光度A與溶液的濃度成線性關係。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中確定最大吸收波長 ，然後以此波長 的光為光源（單色光），進行吸光度A的測定，這是朗伯比爾定律用於定量分析的首要條件。