pcr技能操作考試流程

1、 試劑準備階段

試劑準備是 PCR 操作的第一個流程，需要在試劑貯存和準備區的超淨工作臺或生物安全櫃進行，用確保無汙染的移液器、槍頭及容器等進行分裝。所有的 PCR 體系都應該在  -20℃ 儲存，除了 ddH2O 之外，其餘的試劑組份需完全融化之後再加入，以免影響濃度。配製反應體系應在快速進行，以減少非特異性擴增。體系配製完成之後應馬上進行 PCR 反應。

2. 樣本製備階段

樣本製備是整個 PCR 反應中最為關鍵的環節，在接收樣本時一定要確保樣本的密封性以及樣本編號的唯一性。嚴格遵守操作規程進行加樣操作，操作時候儘量少說話或者不說話。

所有操作需要在生物安全櫃內進行，操作前後生物安全櫃需要進行紫外燈消毒，注意生物安全櫃中物品的排放。戴手套並勤於更換，要有「無核酸觀念」 。

3. 核酸擴增

在核酸擴增環節需要選擇質量好的 Ep 管，裝入反應體系的 EP 管上機前混勻、離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。在樣本檢測的同時設立對照（陽性對照、陰性對照、陰性模板、試劑對照）。同時嚴密檢測 PCR 擴增儀的各項效能指標，其中對 PCR 擴增儀而言溫度控制就意味著質量。

4. 產物分析

常見問題：

1）無 CT 值出現：模板量不足（雜質的引入及反覆凍融的情況等）

2）CT 值出現過晚（大於 38）：各種反應成分的降解或加樣量的不足

3）標準曲線線性相關性不佳：加樣誤差、標準品出現降解等

4）陰性對照有訊號：模板有基因組的汙染

5）擴增效率低：反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解、反應抑制

6）擴增曲線的異常：模板的濃度太高或熒光染料的降解