在PCR擴增實驗中應注意什麼

1、 引物的質量是保證PCR特異性的關鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18～30bp為宜引物中C+G含量宜在50%左右引物內部和引物之間不應含有互補序列引物的鹼基順序與非擴增區域的同源性應小於70%引物的3’末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴格的限制，故引物設計時可在5’末端加上限制性內切酶位點和/或啟動密碼ATG等引物合成後必須純化以去除合成產物中的不完整序列、脫嘌呤產物、鹼基修飾鏈等“雜質”引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會影響反應產量，過高會增加引物二聚或錯配的機率。

2、 Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發生鹼基錯配的機率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優勢在於反應產量高於其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經基因工程改造後，新創出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。資料顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯誤率) (資料來源：美國冷泉港實驗室)。

3、 Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。

4、 dNTP的濃度過高會增加鹼基的錯誤摻入率，使反應特異性下降過低則會導致反應速度下降。使用時4種dNTP必須以等當量濃度配製，均衡的dNTP有利於減少錯配誤差和提高使用效率。

5、 溫度迴圈引數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的範圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。

6、 減低汙染的常規措施：①將PCR試劑、PCR產物及其他分子生物學試劑分開放置②應保持樣品製備、PCR反應液配製與PCR產物分析三個工作區的獨立性③使用陽性和陰性對照④使用最高質量的水配製PCR實驗的所有反應試劑⑤配製好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個包裝僅用於單次實驗⑥製備樣品、配製試劑及反應液時必須戴手套⑦實驗前一定要認真清潔加樣器等。