凍通脊切片怎麼切

一、取材

應儘可能快地採取新鮮的材料，防止組織發生死後變化。

二、速凍

1、將組織塊平放於軟塑瓶蓋或特製小盒內（直徑約2cm）。

2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，將特製小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。

3、當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

4、在製成凍塊，可置入恆冷箱切片機冰凍切片。

5、若需要儲存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。

三、固定

1、樣品託上塗一層OCT包埋膠，將速凍組織置於其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

2、取下組織置於錫箔或者玻片上，樣品託速凍。

3、組織置於樣品託上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。

四、切片

1、恆溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置於低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至5-10μm。

2、切片時，低溫室內溫度以-15℃ ~ -20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

3、切好室溫放置30min後，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱乾燥20min。PBS洗5min×3。

4、進行抗原熱修復，微波熱修復也可，室溫自然冷卻。可用3%H2O2孵育5-10min，消除內源性過氧化物酶的活性。

五、免疫熒光染色

1、冰凍切片室溫晾乾15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時（此步可不洗）。

2、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織乾涸）。

3、將切片放在加了PBS的免疫組化溼盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。

4、第二天將溼盒放到37℃回溫1h，吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。

5、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置於分子雜交箱中37℃孵育1小時。回收二抗，切片置於染缸內，PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。

7、回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理乾淨的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

8、做好的切片放在切片盒內，置於4℃冰箱，可儲存一週左右。

順著肉絲切絲，這樣不會將肉切碎，千萬記住裡脊肉不可斷絲切，看似肉片切得很大，炒肉時就會炒成肉末。也可以跟著它的肉絲方向切成薄一點的片也可以啊。